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同型半胱氨酸通过自噬和内质网应激诱导人系膜细胞凋亡 2019-10-28 15:50:34 来源:万健康品 作者:万健康品 点击:

导语:同型半胱氨酸(Hcy)水平是慢性肾脏病(CKD)进展性增加的特征。事实上,Hcy的积累被认为是CKD进展的一个重要的生化罪魁祸首,但其机制仍不清楚。西安交通大学第一附属医院肾病医院透析科梁珊珊团队通过将人系膜细胞(HMCs)与不同浓度的Hcy孵育不同时间,检测细胞凋亡率、Hcy、内质网抑制剂4-苯基丁酸(4-PBA)和Atg5-siRNA作用后蛋白水平。结果表明,Hcy通过激活内质网应激引起的Atg5-依赖性自噬,以剂量和时间依赖的方式诱导HMC凋亡。本研究提出了一种新的抗Hcy肾损伤的策略,有助于阐明CKD的发病机制。

 

同型半胱氨酸  

 

同型半胱氨酸(Hcy)是蛋氨酸代谢产生的含硫氨基酸,主要在肾脏代谢。Hcy的积聚,即高同型半胱氨酸血症(HHcy),是各种慢性肾脏疾病(CDK)的特征,被认为是CKD发生发展的重要生化罪魁祸首,血浆Hcy水平升高可引起血管收缩和肾微血管损伤,降低肾小球滤过率。

 

内质网是一种存在于哺乳动物细胞中的膜细胞器,其主要功能包括蛋白质合成、修饰和折叠。内质网维持适当蛋白质折叠的能力对包括肾小球系膜细胞(MCs)在内的细胞的功能完整性至关重要。如果内质网中的蛋白质折叠受到干扰,未折叠蛋白将积累并诱导内质网应激(ERS)和一种适应性反应:未折叠蛋白反应(UPR)。UPR可在轻度或短期应激下保护细胞;然而,当应激超过UPR的耐受能力时,内质网导致细胞凋亡。

 

自噬是细胞在应激状态下的另一种适应性反应,自噬过程中自噬体形成并将细胞内容物传递给溶酶体降解,内质网刺激自噬体前体的积累,诱导自噬的现象日益明显,自噬与内质网诱导的细胞凋亡密切相关。

 

考虑到Hcy对肾脏的损伤以及Hcy、ERS、自噬和凋亡之间的潜在联系,梁珊珊团队推测ERS和自噬可能参与Hcy对MCs的损伤。此研究于2019年发表在皇家化学学会期刊上。

 

研究材料及方法

 

细胞培养和高半胱氨酸制备

人肾小球系膜细胞(HMC)(ScienCell Research Laboratories,CA,USA)在补充了10%胎牛血清(FBS)的低葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(HyClone,LA,USA)中进行培养(BI,以色列)在37°C和5%CO2的环境中。每两天更换一次细胞培养基,直到细胞融合。将HMC用0.25%胰蛋白酶和0.9 mM EDTA(HyClone)部分消化后进行传代培养。在不添加FBS的预热低葡萄糖DMEM细胞培养基中制备用于细胞处理的同型半胱氨酸溶液(Sigma-Aldrich,美国,密苏里州),并使其通过0.2μm无菌过滤器。

 

细胞活力测定

为了评估细胞活力,在Hcy处理之前,将每孔5×103HMC接种到96孔板中过夜。随后,将细胞用不同浓度的Hcy(0–1000μmolL-1)处理24 h,然后用250μmolL-1 Hcy处理不同的时间段(0–48 h)。Cell Counting Kit-8(CCK8)细胞增殖和细胞毒性测试试剂盒(Beyotime,中国上海)用于按照制造商的协议评估细胞的活力和增殖能力。通过计算450nm处的吸光度来测量细胞活力。

 

通过荧光激活细胞分选进行凋亡分析

使用AnnexinV-FITC / PI细胞凋亡检测试剂盒(KeyGen Biotech,南京,中国)测量了Hcy诱导的凋亡细胞数量。使用AnnexinV-APC / 7-AAD细胞凋亡检测试剂盒(KeyGen Biotech)测量细胞样品。经过不同处理后收集细胞,并在4°C下以1200 rpm离心3分钟。用PBS洗涤两次后,将细胞重悬于500μL的1x结合缓冲液中,该缓冲液含有5μLPI和5μLFITC-annexinV(或5μlAnnexinV-APC),在室温下无光悬浮15分钟。通过流式细胞仪(CytoFLEX; Beckman)分析样品。每个样品总共1×10 4个细胞,分析了早期(PI阴性和膜联蛋白V阳性细胞)和晚期(PI阳性和膜联蛋白V阳性细胞)的凋亡细胞。

 

蛋白质提取和蛋白质印迹

在不同的处理之后,将细胞用PBS洗涤两次,然后用含有蛋白酶抑制剂[1%混合物和1mmol L-1苯基甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA缓冲液裂解;在冰上放置30分钟。收集细胞裂解物并在12℃离心在4°C下以000 rpm的转速离心20分钟,然后收集上清液。总蛋白质用十二烷基硫酸钠(SDS)采样缓冲液变性并煮沸5分钟。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(6-15%)用于分离总蛋白样品。然后将蛋白质从凝胶转移到聚二氟乙烯(PVDF)膜(美国马萨诸塞州密利波里)。用5%脱脂牛奶封闭1小时后,将膜与一抗在4°C下孵育过夜(GAPDH,兔多克隆抗体,1:1000,Goodhere Biotechnology,杭州,中国; LC3,兔多克隆抗体,1:1。1000,亲和力;裂解的caspase-3,ATF4,CHOP,磷酸化eIF2α,兔单克隆抗体,1:1000,Cell Signaling Technology,MA,美国;Bax,兔单克隆抗体,1:3000;Bcl2,兔多克隆抗体,1:600;p62,兔单克隆抗体,1:1000;GRP78,兔多克隆抗体,1:800,Abcam,英国剑桥;Atg5,1:500;beclin1,1:1500;兔多克隆抗体,Proteintech Group,中国武汉)。第二天,将印迹与过氧化物酶偶联的二抗(Boster,武汉,中国)在室温下孵育1小时。将膜再次洗涤3次,然后用增强化学发光法显影(Thermo Scientific,MA,美国),然后将膜与放射自显影胶片(Kodak,NY,USA)贴合。通过光密度分析定量免疫印迹。

 

4-PBA和Atg5 siRNA干扰的实验

用HCY(250μmol L-1,24 h)处理HMC,不加或加用1 mmol L-1 4-苯基丁酸(4-PBA)(Sigma-Aldrich)预处理2 h。Genefarma(中国上海)设计合成了抗自噬相关基因5(Atg5-homo-695)的小干扰RNA(siRNA)和阴性对照siRNA。在实验开始前1天,每孔共有5×105个HMC接种在6个孔板中,根据制造商的方案,使用Lipofectamine™2000 siRNA转染试剂(Invitrogen)将siRNA瞬时转染细胞。用实时PCR技术分析基因沉默的成功率。转染24小时后,按照实验设计对细胞进行处理,并采集细胞进行进一步分析。

 

统计分析

所有统计分析均采用SPSS 18.0软件包(SPSS inc.,芝加哥,伊利诺伊州,美国)进行。定量数据报告为平均值±扫描电镜。实验组与对照组之间的差异采用Student's t-检验,而多组之间的差异采用单因素方差分析。差异有统计学意义(p<0.05)。

 

结果

 

Hcy对HMCs活力和凋亡的影响

使用各种浓度的Hcy(25、50、100、250、500、1000μmolL-1)处理HMC 24小时,以及使用250μmolL-1 Hcy处理不同的时间段(0、6、12、24或48小时)以评估细胞活力。结果显示,与对照组相比,Hcy处理后的细胞活力以剂量依赖性方式(图1A)和时间依赖性方式(图1B)显着降低(p<0.05)。为了阐明凋亡是否与Hcy诱导的细胞活力降低有关,使用了流式细胞仪对Annexin V / PI染色。结果表明,Hcy还以时间依赖性方式显着诱导凋亡(图1C和E,p<0.05)和剂量依赖性(图1D和F,p <0.05)。此外,以250μmolL-1浓度的Hcy处理24小时后,凋亡相关蛋白Bax和裂解的caspase-3的水平显着增加,而Bcl-2蛋白的水平显着降低(图2A,p<0.05)。这些结果共同表明,Hcy可以诱导HMC凋亡。 

 

 

同型半胱氨酸

图1 Hcy对系膜细胞活力和凋亡比例的影响。HMCs通过用不同浓度的Hcy(25、50、100、250、500和1000μmol L-1)处理24小时和用250μmol L-1浓度的Hcy在不同小时(0、6、12、24、48 h)处理,然后通过CCK-8分析评估细胞活力。与正常对照组相比,随着Hcy浓度的增加和Hcy温育时间的延长,细胞活力以剂量依赖性(A)和时间依赖性(B)显着降低。通过流式细胞术确定用各种浓度的Hcy(C和E)和不同的孵育时间(D和F)处理后的凋亡细胞比例。数据表示为三次重复进行的三个独立实验的平均值±扫描电镜。与对照组相比,*P<0.05,**P<0.01


 

 

 

同型半胱氨酸

图2 Hcy对细胞凋亡,ERS和自噬相关蛋白表达的影响。用250μmolL-1 Hcy处理HMC24小时,然后用Western blotting分析细胞凋亡、内质网和自噬相关蛋白的表达。凋亡相关蛋白Bax和caspase-3的表达水平明显升高,而Bcl-2蛋白(A)的表达水平显著降低。hcy处理后hmc自噬相关蛋白LC3-II/LC3-I比值、beclin1和Atg5蛋白表达水平显著升高,而p62蛋白表达水平显著降低(B)。ERS相关蛋白ATF4、CHOP、GRP78和磷酸化eIF2α水平显著上调(C)。数据显示为三个独立实验的平均值±扫描电镜,一式三份。*P <0.05,与对照组相比。


 

 

Hcy诱导的HMC中的ERS和自噬

为了了解ERS是否参与Hcy诱导的MCs的凋亡,分析了ERS相关蛋白。用Hcy(250μmolL-1)处理HMCs24小时也显示Hcy可以显着上调ATF4,CHOP,GRP78和磷酸化eIF2α蛋白的表达(图2C,p<0.05)。为了进一步探讨自噬是否也参与Hcy诱导的MCs凋亡,还通过蛋白质印迹法测定了与自噬相关的蛋白质的表达水平。用250μmolL-1Hcy处理HMC24小时。Hcy处理后,自噬相关蛋白裂解HMC中的LC3(以LC3-II / LC3-I比率表示),Beclin1和Atg5的水平显着增加。作为自噬的关键下游信号之一,p62蛋白在Hcy干预后显着降低(图2B,p<0.05)。这些结果共同表明,Hcy诱导了ERS,并增加了MC中的自噬活性,这可能参与了Hcy诱导的HMCs凋亡。

 

4-PBA逆转了Hcy诱导的HMC中的ERS和凋亡

4-PBA是一种ERS的有效抑制剂。本研究用4-PBA证实ERS在Hcy诱导的MC细胞凋亡中的重要作用。Annexin V-APC/7-AAD染色的结果表明,在Hcy(250μmolL-1)处理前,用4-PBA(1mmol L-1)预处理的HMC其Hcy诱导的凋亡大大降低,与仅用Hcy处理组(图3A,p<0.05)。与仅使用Hcy处理的组相比,4-PBA联合治疗也显着降低HMCs中CHOP、phospho-eIF2α和裂解caspase-3蛋白的水平(p<0.05)。此外,4-PBA显着逆转了由Hcy诱导的LC3-II/LC3-I比值的增加和p62蛋白的降解。图3B,p<0.05)。这些发现表明,Hcy可能通过p-eIF2α/CHOP ERS途径诱导细胞凋亡和自噬。 

 

 

同型半胱氨酸

图3. 4-PBA干预对Hcy诱导的细胞凋亡、ERS和自噬的影响。流式细胞仪检测HMCs凋亡比例,蛋白质印迹法确定蛋白质水平。与Hcy组相比,用4-PBA预处理显着降低了Hcy诱导的凋亡系膜细胞的比例(A)。ERS相关蛋白CHOP和p-eIF2α的水平降低。自噬相关蛋白LC3-II/LC3-I的比例显着降低,p62蛋白水平显着提高。凋亡相关蛋白裂解的caspase-3的水平也降低了(B)。*P<0.05,Hcy组与对照组; 4-PBA + Hcy组与Hcy组。所有实验至少重复三次。


 

Atg5表达的抑制减弱Hcy诱导的HMCs凋亡

为了进一步探讨自噬在Hcy诱导的HMC凋亡中的作用,在用Hcy处理之前,将HMCs用Atg5 siRNA转染6小时。值得注意的是,与单纯Hcy处理的组相比,Atg5 siRNA干预显着降低了Hcy诱导的MCs凋亡的比例(图4A,p<0.05)。结果还显示,用Atg5 siRNA转染可显着降低Atg5蛋白质表达,并逆转LC3-II/LC3-I比值的升高和p62蛋白的降解,这表明Atg5 siRNA转染可抑制Hcy诱导的自噬(p<0.05)。此外,用Atg5 siRNA转染后,由Hcy诱导的裂解的caspase-3和CHOP蛋白水平的增加也被显着减弱(图4B,p <0.05)。以上结果表明,Atg5依赖性自噬在加速Hcy诱导的MCs的凋亡中发挥着作用。

 

 

同型半胱氨酸

图4. Atg5 siRNA干预对Hcy诱导的自噬,ERS和凋亡的影响。流式细胞仪检测HMCs凋亡比例,蛋白质印迹法确定蛋白质水平。与Hcy组相比,Atg5 siRNA干预降低了Hcy诱导的凋亡HMC的比例(A)。自噬相关蛋白Atg5的水平和LC3-II / LC3-I的比例降低,而p62蛋白的水平则显着提高。凋亡相关蛋白裂解的caspase-3的水平也降低了(B)。#P<0.05,Hcy组与对照组,Atg5 siRNA+Hcy组与Hcy组,所有实验至少重复三次。


 

结论

 

这项研究表明,Hcy可以诱导MCs凋亡,并提供证据表明ERS激活Atg5依赖性自噬在此过程中起关键作用。这些发现可能为抗Hcy在肾脏损伤中的毒性提供了新的策略,并应有助于我们进一步阐明CKD的发病机理。未来的研究将旨在使用体内模型来检验这些假设。

 

 

引用:Shanshan Liang,Hua Liu,Sixiu Liu,Meng Wei,Fanfan Gao,Jinhong Xue,Lingshuang Sun,Meng Wang,Hongli Jiang*andLei Chen;Homocysteine induces human mesangial cell apoptosis viathe involvement of autophagy and endoplasmic reticulum stress

;10.1039/C9RA04248B(Paper)RSC Adv.,2019,9,31720-31727

本文由万健康品译自https://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2019/ra/c9ra04248b,如有版权影响,联系删除。

 

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